长读长测序揭示结直肠癌异常可变剪接图谱与新型治疗靶点

长读长测序揭示结直肠癌异常可变剪接图谱与新型治疗靶点

徐州医科大学肿瘤研究所董东/郑骏年教授团队在Genome Medicine杂志发表题为“Long-read sequencing reveals the landscape of aberrant alternative splicing and novel therapeutic target in colorectal cancer”的文章。该团队利用长读段测序技术，对结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的转录组复杂性进行了深入研究。

研究背景

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均较高。虽然已有一些治疗策略，但许多患者在接受治疗后仍会出现复发或转移，因此需要更深入的了解CRC的发病机制以开发更有效的治疗策略。在基因表达水平上，剪接的复杂性在癌症发生和进展中起着至关重要的作用。因此，对新的剪接事件和潜在的调节机制的深入了解可能为开发治疗CRC的新策略提供新的见解。利用长读段测序技术研究CRC中的转录组复杂性，鉴定新的剪接事件，并探索其功能和调节机制，为开发新的治疗策略提供理论基础。

研究方法

ONT全长转录组测序是指基于牛津纳米孔公司（ONT）三代测序平台进行的全长转录组测序。ONT（纳米孔）测序是一种基于单分子实时电信号的高通量测序技术，适用于DNA/RNA的快速序列分析。该技术通过纳米孔通道，在电压差的作用下，带动DNA/RNA链通过通道，利用不同碱基的电学信号差异实时测定序列。基于递归神经网络（RNN）的复杂算法，ONT能够根据电流信号判定不同的碱基类型，完成序列测定。该技术可准确分析可变剪接、融合基因和鉴定新异构体，实现转录本的表达水平准确定量。

该研究长读长转录组数据分析流程首先使用albacore v1.1.0和Guppy v3.3.0进行碱基识别，porechop v0.2.4去除接头，并通过Nanofilter v2.8.0进行质控。接着，使用minimap2 v2.2.14（参数-ax splice）将质控后的ONT读长比对至hg38参考基因组，并用NanoStat v1.5.0进行统计。利用FLAIR correct v1.5.0，并结合GENCODE v34注释或Illumina短读长数据（要求≥3条支持）校正剪接位点。随后，采用FLAIR collapse v1.5.0（默认设置，包括-n best_only参数，并要求转录本有≥3条高比对质量（MAPQ≥1）的读长支持）组装转录本，生成参考转录组。使用SQANTI3 v1.6.1（基于GENCODE v34）进行转录本注释、分类和质量评估，并通过Fusionseeker v1.0.1检测基因融合。对转录本进行严格过滤：所有剪接点需≥5条短读长支持，转录本在≥10%样本中检出，且具有基于poly(A)位点数据库和注释TTS位置判断的可靠3'末端。利用Salmon v0.10.0和StringTie v2.1.2分别计算长读长和短读长数据的TPM。在蛋白质层面，使用transdecoder v5.5.0（最小ORF长度300bp）预测ORF，通过blastp v2.11.0（E-value<1e-5）比对UniProt数据库和hmmer v3.2.1比对PFAM数据库进行功能注释，并用bigWigAverageOverBed v377计算phyloP和phastCons保守性得分。最后，整合CPTAC的MS/MS数据，使用Maxquant v1.6.10.43（肽段长度≥7 AAs，允许多种修饰和1次错切，FDR<0.01）进行肽段鉴定，并将蛋白根据来源分为ONT_only、ONT+Uniprot和Uniprot_only三组，同时利用DeepLoc和TMHMM预测亚细胞定位和跨膜结构域。

研究结果

1、 使用长读长和短读长测序方法分析结肠癌转录组

研究团队针对78例结肠癌（CRC）患者的癌组织及10例癌旁正常组织，采用ONT三代全长转录组和二代普通转录组测序进行转录组分析（图1A）。通过该研究，团队成功获得了792万个ONT长reads，每个样本的平均reads长度达到1.02 kb。基于GENCODE v34参考转录组，研究团队共鉴定出90,703个转录本（图1B），这些转录本分别定位到18,024个已注释基因和2796个新基因位点。值得注意的是，近60%的基因具有两个或更多的转录本（图1C）。转录本主要分为四种类型：37%为FSM（全匹配转录本）、40%为NIC（新型内含子组合转录本）、17%为NNC（新型非编码转录本）以及0.2%为ISM（内含子保留转录本）。与现有转录组数据库相比，超过62%的转录本为新发现的，其中主要为NIC和NNC类型。进一步分析表明，这些新转录本可能具有样本特异性，能够在较低表达水平上包含更多的外显子。为验证ONT三代全长转录组测序转录本的可靠性，研究团队对比ONT三代全长转录组和二代普通转录组。结果显示，84%的FSM转录本、71%的NIC转录本和55%的NNC转录本在与二代测序鉴定结果一致（图1D），新转录本的5 '端也显示出与FSM转录本相当的质量(图1E)。

2、ONT全长测序鉴定的新转录特征

在对56,790个新发现的结直肠癌（CRC）转录本进行分析后，发现其中36,489个（64%）被归类为无编码（NNC）转录本，15,640个（27%）为有编码（NIC）转录本，揭示了CRC转录组的复杂性。新转录本通常具有更多外显子，但其编码序列较短，并且有更高的可能性包含提前终止密码子，提示这些转录本可能通过无义介导的mRNA降解（NMD）途径被处理。与已知转录本相比，新转录本的表达水平较低。通过比较长读长（ONT）和短读长（Illumina）平台的基因及转录本表达水平，结果表明两者高度一致，且新转录本的平均表达水平低于已知转录本。进一步的通路富集分析发现，高增量新剪接异构体的基因主要与癌症相关的信号通路，如RNA剪接、TGF、JAK/STAT及MYC通路密切相关，其中一些癌基因如CDH17、EZH2和ERBB2显示出较多的新异构体。为了评估非编码转录本的功能，我们还分析了这些转录本的进化保守性，结果表明新转录本的序列保守性较随机对照区域高。对具有较高编码潜力的转录本进行开放阅读框（ORF）分析，发现大多数新转录本具有编码蛋白质的潜力，且其ORF与UniProt数据库中的蛋白质具有较高的相似性。通过LC-MS/MS数据进一步验证，发现3729个NIC转录本和817个NNC转录本编码的ORF得到了质谱支持，表明这些新转录本可能在癌症中新抗原的产生中发挥作用。最后，我们还发现了4538个基因融合事件，其中一些频繁出现的融合事件，如ARHGEF3-CNTNAP2、A2MP1-PTMA和ACAT2-TCP1，可能在CRC中具有重要意义。总体而言，这些结果揭示了CRC转录组中大量未被充分认识的“暗物质”可能在癌症发生和进展中扮演关键角色。

3、 CRC中选择性剪接事件的鉴定

我们基于ONT长读长数据，使用SUPPA2软件注释并量化了七种可变剪接（AS）事件，包括外显子跳跃（SE）、可变3'剪接位点（A3）、可变5'剪接位点（A5）、可变首外显子（AF）、可变末外显子（AL）、内含子滞留（RI）及互斥外显子（MX）（图3A）。共鉴定出2,363,976个AS事件，其中AF事件占比最高，使用GENCODE v34参考仅能识别565,952个。通过过滤条件（PSI频率≥75%，平均PSI≥0.05），最终筛选得到1,085,182个高可信度AS事件，其中352,238个为参考注释事件。UpSet图显示6725个基因同时拥有七类AS事件，超过90%的基因具有两个以上的AS事件（图3B），显著丰富了CRC转录组的多样性。

进一步分析发现，共识别出25,002个差异可变剪接事件（DEAS），其中AF事件占比最大（8898个，占35.59%）（图3C)，且ΔPSI在不同AS类型间无显著差异。基于DEAS事件PSI值的无监督聚类可清晰区分肿瘤与正常样本。对发生DEAS事件的母基因进行GSEA分析，发现其富集于多个关键癌症通路，如G2/M细胞周期检查点、E2F、MYC、纺锤丝、MTORC1等（图3D）。不同类型的AS事件还展现出特异性的通路富集特征，如AF事件显著富集于WNT通路，RI事件则特异性富集于p53通路。进一步识别出多个在MYC通路中发生显著AS改变的关键基因，如_EIF4H_（特异性失去RI事件）、_YWHAE_（AF事件差异显著）、_XPO1_（SE事件）、_EEF1B2_（A3事件）（图3E），提示DEAS事件可能通过调控多种癌症相关通路参与CRC的发生发展。

此外，剪接因子（SFs）在调控RNA剪接中发挥关键作用。我们在67个已知SF基因中鉴定出17个在肿瘤与正常样本间差异表达。进一步构建的SF调控网络显示，13个差异表达的SFs（11上调，2下调）调控了数千个DEAS事件。其中_ELVAL3_与_QKI_调控的DEAS事件和相关通路最多，可能是CRC中关键的调控因子。这些SFs调控的DEAS事件富集于多种癌代谢相关通路，如缺氧、HIF1A信号通路与核糖体功能等。综上，这些结果表明SFs通过调控AS事件广泛参与CRC的代谢重编程及癌症发生，_ELVAL3_、_QKI_、_RBM5_、_HNRNPA1_与_SF1_等核心SF基因可能在CRC进展中扮演重要角色。

4、可变剪接事件相关的临床分析

我们通过单因素Cox分析探索了可变剪接（DEAS）事件与结直肠癌（CRC）患者预后的关系，共鉴定出1472个与预后相关的DEAS事件，涉及1241个基因，其中809个DEAS事件与良好预后相关，663个与差预后相关。特别是，38个基因同时表现出良好和差预后的DEAS事件。其中_FHL2_基因的四个AS事件与CRC患者的总生存期相关，部分剪接事件与较短生存期相关，而其他事件则与较长生存期相关（图4B–D）。这些结果表明，DEAS事件可能作为CRC的预后生物标志物。进一步分析发现，癌症晚期（AJCC III/IV期）与早期（AJCC I/II期）CRC患者的DEAS事件存在显著差异，共识别出998个差异事件，显示AS调控与CRC进展密切相关。此外，我们还分析了CRC远处转移样本中的DEAS，发现596个事件上调，583个事件下调。对于微卫星不稳定性（MSI），我们预测MSI-H患者的DEAS事件上调744个，下调633个，暗示AS异常可能与免疫治疗反应相关。最后，通过对CRC分子亚型（CMS）的分析，我们发现特定亚型（如CMS1、CMS2、CMS3、CMS4）存在特有的AS事件，并且部分AS事件与肿瘤微环境中的间质成分和免疫细胞浸润密切相关。综上，AS事件在CRC的进展、预后以及治疗选择中发挥重要作用，可能成为潜在的生物标志物和治疗靶点。

5、CRC 中 TIMP1 外显子 4-5 剪接失调

研究发现，利用ONT长读长测序数据首次鉴定出人 TIMP1 基因存在一种跳过外显子4-5的可变剪接新转录本（TIMP1 Δ4-5）（图5A）。在结直肠癌（CRC）样本中，该外显子4-5跳跃事件的PSI值显著升高（图3C，图5B）。进一步利用Illumina短读长数据分析发现，在CRC组织中，包含外显子4-5的全长转录本（TIMP1-FL）的mRNA表达水平显著上调，而跳过外显子4-5的转录本（TIMP1 Δ4-5）的表达水平则显著下调（图5C, D）。生存分析显示，TIMP1-FL 的高表达与较差的总生存期相关，而 TIMP1 Δ4-5 的高表达则与较好的生存期相关（图5C, D）。通过设计特异性引物（图5E）并结合Sanger测序（图5F）、RT-PCR和qRT-PCR（图5G, H）在细胞系和临床样本（图5I）中验证了这一现象，结果表明 TIMP1-FL/TIMP1 Δ4-5 的比值在CRC组织中显著升高。综上所述，这些数据揭示了 TIMP1 基因外显子4-5的可变剪接失调存在于CRC样本中，并可能影响患者预后。

6、TIMP1、Δ4-5 和 TIMP-FL 在 CRC 癌变中具有相反的功能

为探究 TIMP1 两种主要转录本 TIMP1-FL 和 TIMP1 Δ4-5 在结直肠癌（CRC）中的功能，研究人员在CRC细胞系（SW480 和 HCT-8）中进行了过表达实验（效率验证见附加文件1：图S9d）。结果显示，过表达 TIMP1 Δ4-5 显著抑制了细胞的生长、迁移和侵袭，而过表达 TIMP1-FL 则显著促进了这些恶性行为，这与先前研究一致（图6A–D）。反之，利用靶向外显子3/6连接处的siRNA特异性敲低 TIMP1 Δ4-5 后（不影响 TIMP1-FL 表达），细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著增强。进一步的体内实验表明，在裸鼠异种移植瘤模型中，过表达 TIMP1 Δ4-5 的细胞形成的肿瘤体积显著小于对照组（图6E–H）。综上所述，这些数据表明 TIMP1-FL 和 TIMP1 Δ4-5 在CRC的发生发展中扮演着截然不同的角色，TIMP1 Δ4-5 可能作为一种潜在的肿瘤抑制因子在CRC中发挥作用。

7、SRSF1调节TIMP1 Δ4-5可变剪接事件

为了探究剪接因子对TIMP1外显子 4–5 包含的调控机制，研究首先通过 RBPmap 预测（图 7A）并结合敲低实验与 RIP 实验（图 7B），证实了 SRSF1 是一个关键的调控因子。进一步实验发现，在 CRC 细胞中敲低 SRSF1 会显著降低 TIMP1-FL（全长）的表达，增加 TIMP1 Δ4-5（外显子 4-5 缺失）的表达，从而显著降低 TIMP1-FL/TIMP1-Δ4-5 的比例（图 7C, D），而总 TIMP1 水平不变。此外，研究还发现 SRSF1 在 CRC 组织中显著上调，敲低 SRSF1 会抑制 CRC 细胞的生长、迁移和侵袭，而这种抑制作用可以通过同时敲低 TIMP1 Δ4-5 来逆转（图 7E, F, G）。总而言之，这些结果共同表明，SRSF1 在结直肠癌中通过促进 TIMP1 基因的外显子 4–5 包含，进而促进了肿瘤的恶性进展。

8、靶向TIMP1可变剪接位点在CRC治疗的潜在价值

本研究利用 CRISPR/dCasRx 系统，设计了针对 TIMP1 前体 mRNA 不同位点的六种 gRNA，并在 SW480 细胞中进行了测试。结果显示，靶向外显子 4-5 供体和受体剪接位点的 gRNA#1 和 gRNA#2 能显著诱导该外显子的跳跃，使 TIMP1 全长转录本（TIMP1-FL）与跳跃转录本（TIMP1 Δ4-5）的比率降低近 50%（图 8A）。进一步的功能实验表明，诱导 TIMP1 外显子 4-5 跳跃显著抑制了 SW480 和 HCT-8 细胞的迁移、侵袭（图 8B-D）以及增殖能力（图 8E）。在体内实验中，通过给裸鼠皮下移植瘤注射 dCasRx-TIMP1 载体，也观察到肿瘤生长受到明显抑制（图 8F-J）。综上所述，基于 CRISPR/dCasRx 诱导 TIMP1 外显子 4-5 跳跃的策略，在抑制结直肠癌（CRC）生长方面展现出潜力。

总结

本研究结合长读长和短读长测序技术，系统解析了结直肠癌（CRC）的转录组复杂性，鉴定出90,703个转录本（62%为新发现）。研究发现新转录本多呈低表达、多外显子特征，且与患者预后显著相关。其中，新剪接变体TIMP1 Δ4-5在CRC中显著下调，功能实验证实其过表达可抑制肿瘤生长和转移。机制上，SRSF1通过调控TIMP1外显子4-5的剪接促进肿瘤进展。基于此，研究开发了CRISPR/dCasRx靶向剪接编辑策略，成功诱导外显子排除并抑制肿瘤生长。该工作不仅为CRC提供了新的预后标志和治疗靶点（如TIMP1 Δ4-5），也为肿瘤剪接调控研究提供了重要资源。

本文参与 腾讯云自媒体同步曝光计划，分享自微信公众号。原始发表：2025-04-23，如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent 删除数据异常crc编码事件