一文打通10X HD Visium上游：从软件部署到上游分析
熟悉我的朋友应该知道，学习一个组学，我一般会从学起，从上游分析到下游，例如为了学习Bulk RNA-seq分析，我会从芯片数据学起，例如：
- 一文解决80%GEO芯片数据分析
- 同时这个过程学习了基因ID转换，关于基因ID转换，一文就够了
- 差异表达分析以及富集分析等，R语言进行TCGA配对样本差异基因分析
学习Bulk RNA-seq分析，我会先从FASTQ上游分析学起，顺带学习了Linux和Conda，例如：
- Linux随笔（一）入门篇
- Linux随笔（二）“软件管家“ conda
- 91例免疫治疗队列（含生存）转录组上游分析实战
有了上面的知识和经验，很快入门了Chip-seq分析：
- ChIPseq实战分析(一)：从fastq到bed
- ChIPseq实战分析(二)：HOMER和MEME的motif分析
还是一样，有了上面分析多组学的知识和经验，很快入门了scRNA-seq分析，scRNA-seq我写的太多了，就不一一列举了：
- 一文打通单细胞上游：从软件部署到上游分析
尽管有了大量实战经验，在单细胞上游分析方面我也踩了不少坑，例如：
- 10X单细胞转录组测序数据的 SRA转fastq踩坑那些事
- 10X单细胞上游 | 一个样本对应多个SRR ID怎么办？
Visium HD 是10X Genomics在2024年最新推出的空间转录组技术，得益于前期的学习和积累，这个技术一出来我就开始学习了，例如：
- 全网首发 | Visium HD空转数据开箱测试
- 跟着Seurat官网学Visium HD空转分析（一）标准分析流程
- 跟着Seurat官网学Visium HD空转分析（二）空间组织域识别和反卷积
然而关于10X HD Visium上游分析流程的学习一直是我的一个小遗憾，搜了一下推文似乎也没有人写过。所以本帖专门对10X HD Visium上游分析的软件部署和流程做一个简要介绍。希望我的学习经验和本帖都能给大家一些参考。
一. 10X HD Visium上游分析环境部署
这里主要涉及到的是spaceranger的安装，10官网有详细的步骤（）：
代码语言：javascript代码运行次数：0运行复制wget -O spaceranger-3.1.3.tar.gz ".1.3.tar.gz?Expires=1743662161&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA&Signature=KsQo6G-WuryCCjpcDDOsk5cWNYIl13C8pTd7u-alfERynAGTTqRWU-4~U7yCgCqDLqwsrZqKYIqtVsqqI1i88xaMhs1V4g6xsSJNDBV9eqCQC9CiaamwK0I5DhH-fbneO0r3mIgmxc9Y5wirRXTYqV-fKVhUoTmfkp90vx1eCjgixiVHQGRDwyDWbhHAzk888d3bDUYliGd-y4x1OCSZQN-cYzzGKrOzPoNWdQXlE~NUv8wIolL6Uj67mAcx0jo1a5BeLhDOhh0yBCQKtwlDU64kKjNCa7dTTk4svIjbyJHB7EM-r79oOdPfn25q~l4xXGu0arOILJgUmCjCkZ1fEQ__"
##解压
tar -xzvf spaceranger-3.1.3.tar.gz
export PATH=~/software_install/spaceranger-3.1.3:$PATH
##绑定邮箱
spaceranger sitecheck > sitecheck.txt
spaceranger upload xxx@xxx.xxx sitecheck.txt
## 我喜欢在10x环境下跑上游
# ln -s ~/software_install/spaceranger-3.1.3/bin/spaceranger ~/miniconda3/envs/10x/bin/
二. 10X HD Visium上游分析的标准流程
这部分也是参考10X官网即可（），大概流程如下：
FASTQ文件的获取，这里跳过了，一般是自测为主的，论文公开的话，我估计要么是不公开的，要么都是缺胳膊少腿的。
spaceranger软件的核心函数就是spaceranger count了，代码其实很简单，但是理解每一个参数和每一个文件需要花费大量的时间：
spaceranger count --id=hd_count \
--transcriptome=/path/to/refdata-gex-GRCh38-2020-A \
--fastqs=/path/to/fastq \
--probe-set=/path/to/Visium_Human_Transcriptome_Probe_Set_v2.0_GRCh38-2020-A.csv \
--slide=H1-YD7CDZK \
--area=A1 \
--cytaimage=/path/to/CAVG10539_2023-11-16_14-56-24_APPS115_H1-YD7CDZK_A1_S11088.tif \
--image=/path/to/APPS115_11088_rescan_01.btf \
--create-bam=false
如果是两年前的话，需要我们自己查阅，虽然很花费时间和精力，但是能学到很多。
现在的话，有小C老师了，还有Deepseek老师，真的可以节省大量时间：
参数 | 文件类型 | 来源说明 |
|---|---|---|
--transcriptome | 参考转录组文件夹（10X格式） | 从10X官网下载 |
--fastqs | 测序数据 FASTQ 文件 | Illumina测序仪输出 |
--probe-set | v2版本的探针CSV文件 | 从10X官网下载 |
--slide | Slide编号 | 样本记录表/玻片标签 |
--area | 玻片区域（A1-D1） | 实验设计决定 |
--cytaimage | 低分辨率组织扫描图像（tif） | CytaScope仪器生成 |
--image | 高分辨率图像（.btf 或 .tif） | Zeiss扫描或原始图像 |
--create-bam | 是否生成 BAM 文件（false 推荐） | 自定义 |
但是AI有一个问题，就是AI多强大取决于用户的知识面多强大，例如，如果我不知道10x visium图片对齐和细胞分割这个概念，AI一般不太会告诉我，甚至即便告诉了我，我也没有概念，不能理解，也无法记住。
拿10x visium图片对齐这个问题举例，这个问题很重要，但是在spaceranger count这个过程是可选的，做与不做取决于用户的目的和数据本身，如果仅仅基于AI跑通了整个spaceranger count流程，囫囵吞枣，虽然可以很快达到目标，但是会遗漏很多的细节。
回到本文的主题，下面讲讲10x visium图片对齐问题：
在 Visium HD 的分析流程中，我们主要涉及两款核心软件：
- Space Ranger：用于在 Linux 命令行中运行，将测序原始数据（FASTQ）转化为空间定位的基因表达矩阵，同时结合显微镜图像进行空间可视化；
- Loupe Browser：可视化工具，适用于 Windows 或 Mac 平台，用于打开 Space Ranger 生成的 .cloupe 文件，帮助进行组织区域选择、图像对齐，以及辅助下游生物学解读。
在 Space Ranger 分析中，我们会将转录本表达的空间位置与组织切片图像进行匹配。但这个自动匹配的过程并不总是完美，有时会出现如下情况：
- 部分组织区域未被自动选中
- 图像背景（HE）与转录本信号前景对不齐
- 组织芯片样本中多个区域希望独立分析
这时，Loupe Browser 的图像对齐功能就显得尤为重要。
具体来说，在分析 Visium HD 数据时，我们会有两张图像：
- CytAssist 图像：与空间转录本定位信息（barcodes）一一对应；
- 高清 HE 图像：通常由显微镜单独扫描，图像质量高，但与转录本坐标存在旋转、翻转、缩放等偏差。
我们可以在 Loupe Browser 中：
- 载入 Space Ranger 生成的 .cloupe 文件
- 叠加 CytAssist 图像与 HE 图像
- 手动进行组织区域选择和图像对齐
- 导出 .json 文件
随后，在重新运行 spaceranger count 时传入该 .json 文件，即可让软件使用预设的组织区域及图像对齐参数，从而实现更精确的空间表达定位。
那么，什么时候应该使用 Loupe Browser 做组织区域选择和对齐呢？
- 默认推荐：直接运行 Space Ranger，无需手动干预（大多数切片已能良好对齐）
- ❗ 必须使用 Loupe Browser 的情况：
- 有组织区域未被自动识别；
- 图像前后景对齐明显偏移；
- 多组织芯片样本中，希望分别提取每个阵列区域进行分析；
- 需要用于发表、公开数据库提交，或精细差异表达分析。
（当然上面的内容我也是借助小C老师生成的。虽然内容本身我有查阅资料交叉验证，如果有说的不对的地方还请各位批评指正。）
得到下游表达矩阵之后，就可以做细胞分割或者标准流程了，例如：
- 全网首发 | Visium HD空转数据开箱测试
- 跟着Seurat官网学Visium HD空转分析（一）标准分析流程
- 跟着Seurat官网学Visium HD空转分析（二）空间组织域识别和反卷积
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